生物碱是一类具有重要生物活性的含氮碱性化合物，包括中枢神经系统、心血管系统、抗菌抗炎、抗病毒、抗癌、降血脂等多方面的药理活性，同时也是中草药中最重要的有效成分之一，生物碱的分离和鉴定具有重要的研究意义。
二维色谱是基于一维色谱柱的分离基础上引入的另一款选择性差异大的二维色谱柱，二维系体的理论峰容量等于第一维和第二维色谱柱峰容量的乘积。根据第一维的馏分是否直接进入第二维，可以分为离线二维和在线二维色谱两大模式。根据第一维的馏分是否全部进入到第二维分离，二维色谱又可以分为中心切割二维（部分切入）和全二维色谱（全部切入）。离线二维的实施相对简单，对仪器没有太多要求；在线二维需要通过接口柱切换技术实现将第一维馏分切入到第二维色谱分离体系中，方法可实现自动化，重复性能好。近年来，二维色谱技术在生物碱的分离分析和分离鉴定中得到越来越广泛的应用。
离线二维色谱通过构建不同色谱分离模式或不同分离体系（如RPLC-RPLC、HILIC-RPLC、NPLC-RPLC、UPCC-RPLC等），提高分离选择性和峰容量，对复杂中药中生物碱化合物的分离分析和分离鉴定具有明显优势，同时该方法具有仪器设备要求简单，适用性广泛，可操作性强等优点。An Ya-ling等人建立了亲水色谱-反相色谱（HILIC´RPLC）和超高效合相色谱-反相色谱（UPCC´RPLC）的离线二维色谱分析方法，即第一维采用了亲水色谱或超临界流体色谱分离模式，第二维采用反相色谱分离模式，结合“四步法”质谱检测，从两个不同品种的伊贝母提取物中共分离鉴定了527个甾体生物碱；Zhou Jian-Liang等人采用一维色谱串联质谱（LC-QTOF-MS/MS）从八个不同品种的伊贝母提取物中分离鉴定了42个甾体生物碱，离线二维分析方法对甾体生物碱的分离鉴定结果远远优于一维色谱。Pan Huiqin等人建立了反相-反相（RPLC´RPLC）的离线二维色谱质谱分析方法，从钩藤提取物中分离鉴定出了1227个吲哚类生物碱，发现了三个吲哚生物碱新化合物，鉴定结果远远优于其他文献。Pan Huiqin等人构建了正相-反相（NP´RP）的离线二维体系，第一维采用正相色谱进行制备，得到的馏分进行第二维反相色谱分析，从荜茇提取物中最终分离鉴定了28个酰胺类生物碱。然而，离线二维技术通常需要对第一维接取的馏分进行浓缩等人工操作过程，导致样品在处理过程中可能存在损失或污染的风险。此外，离线二维存在通量低、方法重复性较差等问题。
在线二维色谱分析方法能一定程度上弥补离线二维分析方法的不足，无需样品浓缩处理、分析时间短、自动化程度高、方法重复性较好。Hu Deping等人建立了反相-反相（RPLC´RPLC）的在线二维色谱质谱分析方法，第一维采用C18反相色谱柱，在碱性pH值流动相条件下先对博落回取物进行一维色谱分离，将一维馏分每隔10分钟自动切入到第二维色谱柱中，第二维色谱柱选择表面键载了不同基团的反相C18柱，流动相采用酸性pH值，利用生物碱在两维色谱柱上分离选择性的不同以及在酸碱pH值条件下色谱保留行为的不同，建立了具有高度正交性的RPLC´RPLC在线二维色谱分离体系，该方法在250分钟内从博落回药材提取物中提取到205个色谱峰，共鉴定39个异喹啉类生物碱化合物，分析时间短、仪器自动化程度高。Long Zhen等人采用了反相-离子交换（RPLC´SCX）在线二维色谱分离体系，分离分析洋金花提取物中的莨菪烷类生物碱，方法采用中心切割二维，将一维反相柱上的山莨菪碱、东莨菪碱和莨菪碱三个主要色谱峰，选择性地切入到第二维离子交换色谱柱中进行在线二维定量分析；三个莨菪烷生物碱在一维色谱柱中基质干扰严重，经过第二维SCX色谱柱进一步分离，能与干扰的杂质基线分离，通过验证，该方法具有良好的精密度和重复性，解决了一维色谱杂质干扰导致的定量不准确的问题。Long Zhen等人建立了一种新型的在线二维色谱分析方法，鉴定了舒必利和多巴酚丁胺药物中的碱性杂质，该方法在RPLC´RPLC二维体系中引入了弱离子交换色谱柱（WAX），可实现仪器在线脱盐，含盐流动相可直接串联质谱检测器，无需手动脱盐处理，实现杂质的快速鉴定。Van de Schans Milou G. M等人采用了RPLC´RPLC多重中心切割在线二维色谱质谱法分离鉴定吡咯里西啶类生物碱，吡咯里西啶类生物碱由于特殊的化学结构具有多个同分异构体，直接采用一维色谱质谱法，同分异构体难以分开，对化合物的定性定量分析均存在干扰；采用中心切割在线二维分析方法，同分异构体在第二维色谱柱上能实现基线分离，该方法一次性分离鉴定出20个吡咯里西啶类生物碱及异构体。相比于上述的离线二维色谱，在线二维色谱自动化程度高、分析时间可控，有利于实现大批量样品分析鉴定。在线二维对仪器要求更高，需合适的柱切换技术，同时要考虑流动相兼容性的问题，这些因素会直接影响在线二维色谱的分离效果，也是在线二维色谱技术需要攻克的重点和难点。
综上所述，二维色谱分离技术相比于一维色谱具有优越的分离能力和分离选择性，对于复杂样品中生物碱的定性定量分析十分重要。无论是在线二维色谱还是离线二维色谱，峰容量和分离选择性的提高是其主要特点及优势，从技术而言，设计发展高正交性的分离材料是构建高正交性二维体系、突破峰容量的核心，是实现复杂中药中大量碱性化合物及同分异构体分离的有效策略。（文/熊乐乐）
